振蕩法評價金屬材料抗菌性能研究初探

時間:2018-12-20 00:27:46 來源:CIAA 點擊量:

王友斌 潘力軍 薛金榮 王俊起
(中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所)
 
[摘 要]  目的:研究振蕩法評價金屬材料抗菌性能的可行性。方法:以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為評價菌種,采用振蕩法對8種金屬材料的抗菌性能進行評價,采用原子吸收法分析溶液中的銅離子濃度。結果:紫銅、氧化處理親水紫銅箔、黃銅和白銅四種銅材料對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性均在99%以上,其他四種材料均沒有表現出抗菌活性。結論:振蕩法可以用來評價金屬材料的抗菌性能。
[關鍵詞]  振蕩法;金屬材料;抗菌
 
Study of Antibacterial Performance of Metal Materials with Oscillation Culture Method
WANG You-bin, PAN Li-jun, XUE Jin-rong, WANG Jun-qi
 (National Institute of Environment Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Prevention and Control, Beijing, 100050)
Abstract  [Objective]  To explore the feasibility of antibacterial performance assessment of metal materials by oscillation culture method. [Methods]  The antibacterial performance of several metal materials were assessed by oscillation culture method and the concentration of Cu(II) ion in the oscillation solution was analyzed by flame absorption spectrophotometric method. [Result]  The antibacterial performance of red copper, oxidized hydrophilic copper, H65 brass and B10 cupronickel for Escherichia coli 8099 and Staphylococcus aureus ATCC 6538 were all over 99%, the others had no antibacterial activity. [Conclusions] The oscillation culture method could be used to assess the antibacterial performance of metal materials. 
Key Words  Oscillation culture method  Metal material  Antibacterial
  
金屬及其復合材料具有良好的抗菌性能,已被廣泛應用于各種抗菌領域。負載多層銀銅膜的導尿管表面具有良好的抗菌活性,與濃度為2.68×106 cfu/ mL 的金黃色葡萄球菌液接觸10 h,菌液中菌落數大幅度減少;接觸24 h,金黃色葡萄球菌全部被滅活[1]。但是目前我國缺乏對金屬材料抗菌性能評價的衛生檢測方法和標準,不利于產品的規范管理和使用,因此建立快速、簡便、可靠、易行的金屬材料抗菌性能評價方法十分重要。振蕩法是一種評價抗菌織物抗菌性能的檢測方法,具有檢測結果準確可靠等優點。本文以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為測試菌種,采用振蕩法評價幾種金屬材料的抗菌性能,探討振蕩法評價金屬材料抗菌性能的可行性。
  
1材料和方法
1.1材料
1.1.1 試驗樣品
紫銅、氧化處理親水紫銅箔、H65黃銅、B10白銅、不銹鋼304、不銹鋼316L、抗菌塑料和空調用親水鋁箔8種材料。
三種銅合金的成分構成如下:
紫銅:Cu99.9%,S<0.005%,Sn<0.002%,Pb<0.005%,Fe<0.005%,Ni<0.005%, Sb<0.002%,Bi<0.001%,As<0.002%,Zn<0.005%,O<0.06%;H65黃銅:Cu65%,Zn<34.6%,Fe<0.1%,Pb<0.03%,Sb<0.005%,Bi<0.002%,P<0.01%;B10白銅:Cu90%,Ni<9%,Fe<1%,Mn微量。
1.1.2 對照樣品
3mm厚石英玻璃片。
1.1.3 菌種
金黃色葡萄球菌(ATCC6538)和大腸桿菌(8099)購自中國藥品生物制品研究所。
將37℃培養24h的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌斜面分別挑取適量于無菌0.03 mol/L的PBS 溶液中,混合、逐步稀釋至菌懸液濃度為106-107cfu/mL待用。
1.1.4 試驗器材
震蕩混旋器,生物安全柜,電熱恒溫培養箱,1mL、5mL滅菌吸管,滅菌試管,接種環,壓力蒸汽滅菌器,直徑為90mm的滅菌平皿和250mL滅菌三角燒瓶。
1.2 方法
1.2.1樣品預處理
(1)將試驗樣品切割成10 mm×10 mm的方形樣片。試驗樣品先用75%乙醇溶液浸泡,再用無菌蒸餾水反復沖洗,無菌蒸餾水浸泡過夜,56℃烘干。
(2)空白對照樣品用75%酒精浸泡20分鐘后,用無菌蒸餾水沖洗干凈,56℃烘干。然后將試驗樣品和空白對照樣品置于已滅菌的250 mL三角燒瓶中。
1.2.2試驗步驟
(1)將0.75 g試驗樣片放入250 mL三角燒瓶中,分別加入70 mL PBS和5 mL菌懸液,使試驗菌在PBS溶液中的濃度為104~105 cfu /mL。
(2)將三角燒瓶固定于振蕩搖床上,在溫度20~25℃的條件下,300 r/min振蕩2 min。吸取1.0 mL作為振蕩前樣液,用PBS溶液適當稀釋后以瓊脂傾注法接種平皿,每個樣液接種兩個平皿,培養后計數菌數。振蕩在達到設定作用時間時,吸取樣液1.0 mL,用PBS溶液適當稀釋后以瓊脂傾注法接種平皿,每個樣液接種兩個平皿,培養后計數菌數。同時吸取樣液1.0 mL,采用原子吸收法測定溶液中的銅離子濃度[4]
試驗同時設對照樣片組和不加樣片組。對照樣片組以不含抗菌材質、大小相同的對照樣片代替抗菌樣片,本試驗采用3mm厚石英玻璃片為對照樣片,其他操作程序與試驗組相同。不加樣片組分別取5 mL菌懸液和70 mL PBS溶液加入250 mL三角燒瓶中,其他操作程序與試驗組相同。
1.3數據分析及效果評價

式中:
R:抑菌率,單位為(%):
A:樣品振蕩前平均菌落數,單位為(cfu/mL);
B:樣品振蕩后平均菌落數,單位為(cfu/mL)。
 
2 結果
2.1不同菌種對金屬材料抗菌性能評價結果的影響
(1)金黃色葡萄球菌
表1  金黃色葡萄球菌對金屬材料抗菌性能評價結果的影響     單位:(cfu/mL)
材料 暴露時間
0h 2h 4h 8h 24h
紫銅 5.04×104 1.35×104 9.8×103 161 26
氧化處理親水紫銅箔 5.04×104 1.30×104 1.13×104 21 5
H65黃銅 5.04×104 1.42×104 1.02×104 10 1
白銅 1.19×104 8.0×103 5.0×103 13 1
不銹鋼304 5.04×104 1.81×104 1.87×104 1.76×104 2.69×104
空調用親水鋁箔 5.04×104 1.86×104 1.83×104 1.59×104 2.42×104
不銹鋼316L 1.19×104 1.18×104 1.38×104 1.13×104 1.29×104
塑料 1.19×104 1.17×104 1.04×104 1.06×104 1.24×104
表1為不同金屬材料在不同振蕩暴露時間對金黃色葡萄球菌的抗菌試驗結果。在振蕩時間為2h時,紫銅、氧化處理親水紫銅箔和黃銅振蕩溶液中的菌落數分別減少73.21%、74.21%和71.82%;白銅振蕩液中菌落數僅降低32.77%;不銹鋼304和空調用親水鋁箔振蕩液中菌落數分別降低64.09%和63.10%;不銹鋼316L和塑料振蕩液中的菌落數沒有變化。當時間增加到8h時,紫銅、氧化處理親水紫銅箔、黃銅和白銅均顯示出明顯的抗菌活性,分別為99.68%、99.95%、99.98%和99.89%;不銹鋼304、空調用親水鋁箔、不銹鋼316L和塑料與2h的結果無差別。當時間提高到24h,紫銅、氧化處理親水紫銅箔、黃銅和白銅四種銅材料的抗菌活性均達99.94%以上;其他四種材料則均未表現出抗菌活性。
(2)大腸桿菌          
表2  大腸桿菌對金屬材料抗菌性能評價結果的影響     單位:(cfu/mL)
材料 暴露時間
0h 2h 4h 8h 24h
紫銅 2.64×104 1.02×104 1.02×103 2.10×102 6
氧化處理親水紫銅箔 2.64×104 1.24×104 1.36×103 1.59×102 11
H65黃銅 2.64×104 8.64×103 6.67×103 1.39×102 9
白銅 1.61×104 1.38×104 1.34×104 1.49×104 10
不銹鋼304 2.64×104 1.98×104 2.38×104 1.02×104 1.38×105
空調用親水鋁箔 2.64×104 1.86×104 1.23×104 9.9×103 7.50×103
不銹鋼316L 1.61×104 1.49×104 1.33×104 1.42×104 2.08×104
塑料 1.61×104 1.54×104 1.29×104 1.44×104 2.11×104
表2為不同金屬材料在不同振蕩暴露時間對大腸桿菌的抗菌試驗結果。在振蕩2h時,上述8種材料振蕩溶液中的菌落數均無明顯變化。振蕩時間增加到8h時,紫銅、氧化處理親水紫銅箔和黃銅已經表現出明顯抗菌活性,抗菌活性均在99.2%以上;白銅、不銹鋼304、不銹鋼316L和塑料沒有表現出明顯抗菌活性,空調用親水鋁箔振蕩液中的菌落數降低63.5%。當振蕩暴露時間提高到24h,紫銅、氧化處理親水紫銅箔、黃銅和白銅四種銅材的抗菌活性均在99.93%以上;不銹鋼304、不銹鋼316L和塑料則均未表現出抗菌活性,空調用親水鋁箔的菌落數降低幅度與8h時無明顯差異。
2.3 振蕩時間對金屬材料抗菌性能評價結果的影響
表3          不同振蕩時間銅離子的溶出狀況              單位:(mg/L)
材料種類 2h 4h 8h 12h 16h 24h
紫銅 0.40 2.28 1.68 1.49 1.42 1.21
氧化處理親水紫銅 0.5 1.06 2.78 2.29 1.48 0.98
黃銅 0.72 1.10 1.54 1.40 1.31 1.46
白銅 0.35 0. 75 1.47 1.23 1.14 1.04
8種金屬材料中紫銅、氧化處理親水紫銅箔、黃銅和白銅均表現出抗菌活性。紫銅、氧化處理親水紫銅箔、黃銅和白銅四種銅材料分別是99%以上的純銅、經過表面鈍化處理的純銅、銅鋅合金以及銅鎳合金。從抗菌試驗評價結果可知,盡管都是含銅材料,但是在不同振蕩暴露時間表現出的抗菌活性不相同。因此分析四種銅材料振蕩溶液中的銅離子濃度,試驗結果見表3。
從表3數據可見,紫銅溶液中銅離子濃度最高點在4h,為2.28mg/L,氧化處理親水紫銅、黃銅和白銅的銅離子濃度最高點均在8h,分別為2.78 mg/L、1.54 mg/L和1.47 mg/L。四種銅材料振蕩溶液中銅離子濃度均隨時間先增加后逐漸降低,最后趨于穩定。
 
3 討論
金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性能評價結果表明,在不同菌種抗菌性能評價試驗,4種銅材均表現出抗菌活性,而其他4種均沒有抗菌活性,沒有出現假陽性的研究結果。這表明振蕩法可以用于評價金屬材料的抗菌性能。但是采用振蕩法評價金屬材料抗菌性能時,每種評價材料的振蕩時間必需一致,本研究表明振蕩時間至少為24 h。
振蕩溶液中銅離子濃度先升高后降低的原因可能是由于溶出的銅離子與菌體發生作用,改變了銅離子的性態,降低溶液中Cu(II)離子濃度;隨著溶液中菌落數的不斷減少,銅離子濃度受微生物的影響越來越小,而受到銅表面與溶液中銅離子的作用影響越來越大,當二者達到平衡時,銅離子濃度趨于穩定。銅離子濃度峰值出現的時間不同可能是導致不同的銅材料在同一時間顯示出不同抗菌活性的原因。
 
參考文獻
1 Hussain AA, Sayer M, Vincent PJ, Hughes DJ, Smith TJ. Antibacterial activity of multilayer silver-copper surface films on catheter material. Can-J-Microbiol. 1993,39(9):895-899
2 隆泉,鄭保忠,孔輝.抗菌織物的抗菌性快速檢測方法研究:奎因法的改良.上海紡織科技.2007,35(4):122-124
3童忠良.無機抗菌新材料與技術.北京:化學工業出版社,2006:12-23
4中華人民共和國衛生部. GB/T 5750.6-2006生活飲用水標準檢驗方法 金屬指標
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